HiBiT for Endogenous Protein Study

HiBiT®：一种用于扩展内源蛋白检测的微小标签

 

Promega公司开发了使用HiBiT®标签标记内源蛋白的方法。HiBiT®是一种由11个氨基酸组成的短肽，能以高亲和力与名为LgBiT®的大亚基结合。结合后的复合物具有萤光素酶活性，在添加呋喃嗪（Furimazine）底物后会释放发光信号。研究表明，HiBiT®技术高度定量、极其灵敏，且远比传统免疫分析方法快速。

 

HiBiT®技术的灵敏、快速、定量检测内源蛋白的特点，主要体现在以下方面。

 

检测低丰度蛋白
某些蛋白无处不在，而另一些则十分稀有。许多低丰度蛋白在细胞功能中扮演重要角色，但难以检测和定量。HiBiT®检测基于生物化学发光技术，其灵敏度高于基于荧光团的方法（如GFP），从而能够实现极低水平下的检测，不仅灵敏、而且高度定量。纯化的HiBiT®标记蛋白的连续稀释可产生至少跨越7个数量级的宽线性范围。发光信号在低于1阿摩尔（amol）的水平下仍可被检测到。

 

获得更高的插入效率
目前，标记追踪内源蛋白最简便的方法是使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将报告基因（如GFP或萤光素酶）插入内源基因位点。这些大型报告基因通常需要质粒供体，插入效率较低。相比之下，HiBiT®非常微小，它仅需单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体，能获得高得多的插入效率。

 

HiBiT®标签不会干扰蛋白
庞大的报告基因会干扰蛋白功能并导致其行为异常。由于HiBiT®非常小，其影响正常蛋白功能的可能性被降至最低。

 

HiBiT®检测省时省力
HiBiT®检测非常简单：只需将Nano-Glo® HiBiT裂解检测试剂加入细胞中，等待10分钟，然后将板放入酶标仪检测即可。该方案比基于抗体的方法快得多，因为它不涉及封闭、洗涤或抗体孵育步骤。如需扩展方法来验证生物化学发光的结果，Anti-HiBiT单克隆抗体可支持诸如免疫印迹（Western blot）、免疫荧光（IF）、免疫沉淀（IP）和荧光激活细胞分选（FACS）等应用。

 

可轻松检测原代细胞中的内源蛋白
HeLa等细胞系虽然常用，但研究还可能需要在更具生物学相关性的环境中观察蛋白，例如原代细胞。然而，原代细胞可能更难操作，它们通常生长较慢，且转染/插入效率较低。在传统研究方案中，为了分析蛋白丰度，可能需要对细胞进行分选并分离克隆以获得可检测的信号，而某些原代细胞可能在研究获得结果前就已死亡。

对于HiBiT®，由于其高灵敏度，无需分离克隆。例如在原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行编辑，使其表达HiBiT®标记的HIF1α，能够在未经克隆分离的情况下，检测到多种药物处理后HIF1α-HiBiT®水平的增加，从而可在编辑后24-48小时内完成测量。

 

可实时检测活细胞中的蛋白
蛋白质是动态的，会不断发生表达、运输、相互作用、修饰和降解以响应环境变化——并且这些过程发生迅速。例如，HIF1α的表达在低氧条件下会增加，但一旦重新供氧便会迅速降解。传统中，这种动态过程可能要求在多块板上制备细胞，每五分钟裂解一块板，然后对所有样品进行Western blot来监测这一变化。而利用HiBiT®，可以在同一块活细胞板上进行实时监测，甚至可以用生物发光成像仪在细胞中实时观察蛋白的定位。当然，实时测量需要一个额外步骤，即通过病毒递送或质粒转染引入LgBiT®亚基，因为LgBiT®无法穿透细胞膜。

 

总之，HiBiT®标记是一种灵敏、可靠且快速的方法，可用于测量内源蛋白的水平和修饰。 HiBiT®可广泛应用于蛋白质动力学研究以及药物发现领域。对于可能没有合格免疫分析抗体的药物靶点蛋白，HiBiT®也提供了一种可靠的替代方案，并与高通量处理兼容。